Nature | “你笑起来实都雅，像春天的花一样”—天使综合征赶上基因编纂

撰文 | 木兰之枻

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天使综合征（Angelman syndrome，简称AS）是一种严峻的神经发育性疾病，该病的次要临床表示为严峻发育落后、智力低下、语言障碍、运动或平衡障碍、行为异常伴大笑、浅笑和兴奋，小头畸形和癫痫也较为常见，发育落后常在出生6个月被发现，但1岁前AS临床表征不明显。其发病多源自母源UBE3A基因拷贝的突变或缺失。

患者体内父源UBE3A基因拷贝虽无变异，但lncRNA UBE3A-ATS会通过顺式感化按捺神经元中父源UBE3A的表达，最末招致发病。为治疗天使综合征，研究者曾测验考试用药物或反义寡核苷酸（ASOs）按捺UBE3A-ATS的表达【1,2】。那类疗法固然效果不俗，但药效时间短，患者需要持续承受打针治疗。

理论而言，基因治疗可制止持续治疗带来的未便和痛苦，是遗传性疾病治疗的新标的目的。近年来研究者也证明，CRISPR-Cas9基因编纂手艺能永久降低lncRNA的表达【3】，那或能为天使综合征的基因治疗带来新的希望

2020年10月21日，来自北卡罗来纳大学教堂山分校（UNC）神经科学中心的Mark J. Zylka尝试室在Nature颁发题为Cas9 gene therapy for Angelman syndrome traps Ube3a-ATS long non-coding RNA 的论文。文章发现，通过CRISPR-Cas9系统靶向位于Ube3a-ATS基因3’端的Snord115基因可有效激活神经元中Ube3a基因的表达。

进一步研究发现，在AS小鼠模子的胚胎期及出生后早期，通过AAV病毒系统递送靶向Snord115基因的SaCas9系统可持续激活大脑中Ube3a的表达并改善其小脑畸形及行为学异常。机造研究指出，AAV病毒能整合入靶位点并毁坏Ube3a-ATS的表达，最末改善了AS小鼠模子的各类异常。

研究伊始，研究者以SpCas9系统为根底，设想出可靶向Ube3a-ATS基因及相邻区域的260种sgRNAs停止系统性挑选，成果发现靶向Snord115和Snord116基因及相邻位点的sgRNAs能有效激活Ube3a表达（图1）。有鉴于SNORD116基因缺失会招致Prader-Willi综合症，研究者选后续研究存眷于靶向Snord115基因的sgRNAs对天使综合征的治疗效果。

Snord115在基因组中具有很高的拷贝数，其以基因簇的形式位于Ube3a-ATS基因3’端。前期挑选中发现，在Snord115基因簇中具76个靶位点的sgRNA（定名为Spjw33）对Ube3a表达的激活效果更佳。

后续阐发指出，Spjw33介导的基因编纂可有效按捺Snord115及其上下流的lpw和Ube3a-ATS的表达。此外，通过设想并检测一系列具差别靶位点数目标sgRNAs对Ube3a的激活效果，研究者发现，靶向Snord115的sgRNAs对Ube3a表达的激活才能与靶位点数目成正相关。

图1 sgRNAs的挑选及对Ube3a表达的激活

目前基因治疗范畴平安性更高且应用最为普遍的递送系统为AAV病毒系统，但该系统包拆才能有限，SpCas9基因编纂系统其实不适用。为克制那一困难，研究者改用小型化的SaCas9系统并挑选出高效的sgRNA（Sajw33）用于AAV9病毒包拆，以开展AS小鼠模子中的基因治疗研究。在AS小鼠胚胎期E15.5及出生后P1期，研究者分两次在脑室内打针相关的AAV9病毒，并在30-90天后检测小鼠大脑中UBE3A的表达。

成果显示SaCas9-AAV9基因编纂系统可有效激活中枢神经系统中父源UBE3A的表达，其表达量接近野生型小鼠的40%。研究还指出，在AS小鼠E15.5期单次打针SaCas9-AAV9基因编纂系统17个月后，仍然可察看到父源UBE3A表达的明显激活。

就疗效而言，研究者发现，SaCas9-AAV9系统能明显改善AS小鼠模子的小头畸形、本体觉得及运动才能。此外，AS小鼠模子的瘦削症状也能得到明显改善。就平安性而言，研究者并未察看到SaCas9-AAV9基因编纂系统对AS小鼠后代及其它组织有不良影响。

最初，研究者对SaCas9-AAV9基因编纂系统治疗天使综合征的机造停止了阐发，成果出人意料：sgRNA靶位点处并没有明显的插入缺失突变或点突变，Snord115基因的拷贝数也没有明显改动。进一步的阐发指出，SaCas9-AAV9系统对UBE3A-ATS的按捺源自AAV病毒载体在靶位点处的高效整合，且正反向整合均会毁坏的UBE3A-ATS表达，从而激活父源Ube3a的表达并最末实现天使综合征的治疗。

总体而言，本研究操纵CRISPR-Cas9基因编纂手艺胜利的实现了天使综合征小鼠模子的基因治疗，并在治疗机造上有全新的发现。那一研究为遗传性神经发育性疾病的治疗供给了新思绪，也极大的拓展了研究者对基因治疗机造的认识。在此研究的根底上，基因治疗范畴或能觅得新的契机，从而获得更多功效。

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2835-2

参考文献

1. Huang, H. S. et al. Topoisomerase inhibitors unsilence the dormant allele of Ube3a in neurons.Nature 481, 185–189 (2011).

2. Meng, L. et al. Truncation of Ube3a-ATS unsilences paternal Ube3a and ameliorates behavioral defects in the Angelman syndrome mouse model. PLoS Genet. 9, e1004039 (2013).

3. Zhu, S. et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR–Cas9 library. Nat. Biotechnol. 34, 1279–1286 (2016).