深度解析CAR-NK疗法的宿世此生。什么是CAR-NK？什么是过继细胞免疫治疗(Adoptive Cell Transfer Therapy, ACT)？

一、过继细胞免疫治疗开展过程。

过继细胞免疫治疗(Adoptive Cell Transfer Therapy, ACT)是跟着免疫学的开展而不竭开展的，人们认识到本身体内的 B细胞、T 细胞、NK 细胞等自己就有清扫癌细胞的功用，由此降生了将体外活化和扩增的自体或异体免疫效应细胞输注患者体内进而停止治疗的设法。到如今为行，过继细胞免疫治疗已颠末了四代的开展。

细胞治疗开展过程类型名称手艺特点第一代（非特异性）LAK（淋巴因子激活的杀伤细胞疗法）淋巴因子诱导产生，广谱杀伤感化；临床效果不切当，已较少用第二代（非特异性）CIK（细胞因子诱导的杀伤细胞）次要为NKT 细胞（NK样T淋巴细胞）；与 LAK细胞比拟，CIK 细胞增殖更快，杀瘤活性更高，杀瘤谱更广第三代（非特异性）DC-CIK（细胞因子诱导的杀伤细胞-树突状细胞混合疗法）混合培育加强杀伤效果第四代（特异性）CAR-T（嵌合抗原受体T细胞）不需要抗原递呈，靶向性克制免疫逃逸，多靶向可能，体内持久存活，多肿瘤表达不异抗原应用广

二、什么是CAR-NK疗法？

2.1、NK细胞

人类天然杀伤细胞（NK）来源于CD34+共淋巴祖细胞，半衰期大约为7~10天，占人类外周血淋巴细胞总数的10-15%。按照其表型和功用，NK细胞可分为CD56brightCD16-（约10%）和CD56dimCD16+（约90%）两个亚群。此中CD56brightNK细胞具有较低的细胞消融才能和较强的细胞因子合成才能，而CD56dimNK细胞则相反，有丰硕的胞内穿孔素和较强的细胞毒性。

NK细胞是先本性淋巴细胞，有细胞毒性和免疫调理双重功用。和T细胞一样，NK细胞外表有浩瀚受体，分为激活性和按捺性受体两类，当NK细胞与安康细胞接触时，安康细胞的的MHC分子会激活NK的按捺性受体，制止NK细胞的激活对安康细胞的误伤。一旦被激活，NK细胞能够排泄IFN-γ等多种细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-13等），停止抗体依赖的细胞介导的细胞毒性感化（ADCC）和触发穿孔素/颗粒酶诱导的靶细胞裂解。它们可以精准地攻击和肃清不一般的细胞，同时可调理机体的免疫形态和免疫功用。

安康细胞外表的MHC分子激活NK细胞上的按捺性受体，按捺NK细胞激活。当肿瘤细胞外表的MHC分子丧失或者上调激活信号时，激活NK细胞对肿瘤的杀伤NK细胞介导的肿瘤毒性机造

2.2、NK细胞来源

NK细胞来源丰硕，能够从外周血（PB）、脐带血（UCB）、人类胚胎干细胞（HESC）、诱导多能干细胞（IPSC）和NK细胞系中产生。此中NK细胞系包罗NK-92、NKG、YT、NK-YS、HANK-1、YTS、NKL等，NK-92细胞系是从一位患有急进性非霍奇金淋巴瘤的50岁白人男性外周血单核细胞衍生来的一株IL-2依赖型NK细胞株。

数据统计显示利用NK-92细胞系开展的CAR-NK临床研究最多，相较于原代NK细胞更大的优势在于不涉及分选纯化步调、体外扩增得到的细胞群体一致性更好、其外表的杀伤按捺受体表达很低从而具有更优良的杀伤才能，但因为回输前需要做灭活处置，临床前及临床效果较差，远不如其他两种来源的NK细胞。

本身来源的NK细胞次要通过采外周血、脐带血后别离获得。外周血来源的NK细胞（PB-NKs）细胞具有平安性高、杀伤活性强的长处，但是细胞纯度低且难以大量扩增、低温保留会影响细胞活性，给规模化消费带来较大挑战；脐带血来源的NK细胞（CB-NKs或UCB-NKs）可分化扩增且获得不错的临床数据，但是缺点在于未完全分化、杀伤力有限、且有致瘤性风险。本身来源的NK细胞因为分类和培育成本昂扬，逐步被放弃。

目前临床试验中选用的定向分化为NK细胞的干细胞为人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞。iPSC定向分化的NK细胞（iNKs）的研究热度很高，是目前国表里浩瀚公司次要接纳的一个NK细胞来源。iNKs综合了原代NK细胞和NK-92细胞系的长处，表型与原代NK细胞更为接近，生长才能强，有利于获得充沛且同量的细胞，更容易满足临床应用要求。不外iNKs手艺难度较高，平安性和临床有效性仍需面对监管挑战；也存在潜在的致癌风险，已有大量研究从表不雅遗传润色、染色量组织、代谢重编程等路子来按捺其致癌潜能。别的，也有研究接纳CD34+ HPC向NK细胞定向诱导分化的体例获得NK细胞。

目前已知的NK细胞系

2.3、CAR-NK细胞疗法感化机理

CAR-NK是加强版的NK细胞，是指将NK细胞颠末嵌合抗原受体（CAR）基因润色，付与NK细胞靶向识别肿瘤细胞的才能，颠末体外扩展后注入人体从而到达肿瘤治疗的效果。嵌合抗原受体能显著进步NK细胞疗效特异性，那个思绪和CAR-T的构建类似。CAR构造包罗胞外的识别构造域（如scFv）用来识别肿瘤特异性抗原，一个跨膜构造域和一个胞内信号构造域（CD3ζ链）。革新后的免疫细胞就像加拆了红外造导功用的导弹，能够识别肿瘤细胞，实现精准杀灭。

除了通过单链抗体识别肿瘤外表抗本来按捺癌细胞外，NK细胞还能够通过多种受体识别各类配体来按捺癌细胞，例如天然细胞毒性受体（NKp46、NKp44和NKp30）、NKG2D和DNAM-1（CD226）。那些NK细胞受体凡是识别在免疫细胞或持久治疗压力下肿瘤细胞上表达的应激诱导配体。此外，NK细胞通过FcγRIII（CD16）诱导抗体依赖性细胞毒性。因而，CAR-NK细胞可通过CAR依赖和NK细胞受体依赖性路子按捺癌细胞，从而消弭肿瘤抗原阳性癌细胞或表达NK细胞受体配体的癌细胞。

2.4、CAR-NK转染体例

跟着基因润色手艺的前进，许多办法被用于产生CAR-NK。两种次要办法是病毒转导（慢病毒或逆转录病毒），转染裸量粒DNA、转座酶DNA介导整合以及mRNA电转也较为常用。

（1）慢病毒

慢病毒具有较低遗传毒性和插入诱变感化，可以高效地转导周期性和非周期性细胞，但慢病毒在原代NK细胞中的转导效率很低，凡是需要多轮转导。慢病毒润色的狒狒包膜糖卵白（BaEVgp）假型化的慢病毒载体可进步转染效率。同样，用长臂猿猿猴白血病病毒的包膜卵白假型化的慢病毒也能有效地转导NK细胞。

（2）逆转录病毒

几十年来，逆转录病毒不断被用做基因治疗载体。逆转录病毒载体转染NK细胞效率为27％-52％，编码排泄型IL-15或膜连系型IL-15（mIL-15）基因的逆转录病毒的转导效率可达70％。差别品种的逆转录病毒被用来产生CAR-NK细胞。与γ逆转录病毒和慢病毒比拟，RD114α逆转录病毒在原代NK细胞的转导效率上更高。然而那种办法有两个短处：一是病毒可插入到基因组，招致细胞癌变；二是逆转录病毒转染会按捺原代NK细胞活力。截行到2021岁尾，已经有20项利用CAR-NK细胞系的研究和15项利用原代NK细胞的研究应用了逆转录病毒。

（3）mRNA电穿孔

mRNA转染CAR-NK细胞是一种快速、有效但是感化短暂的一种办法。。研究表白，在异种移植肿瘤模子中，用mRNA办法电穿孔24小时后受体表达程度超越80%，转染mRNA的NK细胞表示出明显的细胞毒性。一般来说，扩增或活化的NK细胞的mRNA转染效率远高于新颖别离的NK细胞。因为mRNA的合成契合GMP的规定，而且电穿孔能够在干净室中停止，因而通过mRNA电穿孔产生契合GMP的CAR-NK是可行的。然而，那种办法的次要缺点是CAR表达的窗口短暂，电穿孔后CAR-NK细胞应在7天内输回患者体内。

（4）睡美人转座子

DNA转座子是可挪动的DNA元件，可通过“剪切和粘贴”机造在载体和染色体之间有效转座，产生不变表达CAR分子的CAR-iPSC-NK细胞。PiggyBac（PB）和“睡美人”（SB）是两个最常用转座子系统。基于转座子的系统能够在预定的位置高效地导入CAR转基因，那是传统办法所不具备的。与病毒载体比拟，转座子系统免疫原性低、生物平安性高、消费成本低，具有转导长度大于100 kb大基因片段的才能。转座子次要通过电穿孔导入NK细胞，然后通过转座子酶整合到宿主基因组中，但存在低转导效率和量粒DNA电穿孔招致NK细胞灭亡等缺点。目前已有两项研究应用转座子系统来产生CAR-NK细胞：一项利用NK-92-MI细胞，另一项研究将转座子转染到iPSC细胞后分化成NK细胞。

（5）CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9是一种强大的基因革新手艺，将Cas9卵白与引导RNA一路导入NK细胞。那种手艺最后被用于原代NK细胞以毁坏CD38基因，避免NK细胞与抗CD38结合利用时的自相残杀。比来CRISPR/Cas9被用于引入新基因。在一些接纳HDR模板的研究中，利用K562-mIL-21扩增的NK细胞获得了超越75%的敲入效率。但在新颖NK细胞中，敲入效率仅为3–16%。

CAR-NK的基因转导

2.5、NK细胞扩增与造备

按照培育工艺的特点，NK细胞扩增手艺归纳综合起来次要分为两类：

（1）滋养细胞（Feeder Cell）+细胞因子的培育工艺（Feeder-Dependent）

该类办法广为接纳的滋养细胞为K562细胞或经基因革新的K562细胞，该细胞外表能够不变表达多种细胞因子受体，在多种细胞因子协同感化下，外周血单个核细胞中的天然杀伤细胞得到定向激活和扩增。该类培育工艺的长处在于细胞扩增活率高、速度快，CD56 brightNK细胞纯度高，CD16等受体表达比例高，所收成的NK细胞具有较强的杀伤性。有研究报导，颠末如许的培育体例能够收成扩增超越300倍的NK细胞。不外该办法引入的细胞为肿瘤细胞，其潜在风险难以完全消弭，而且引入滋养细胞后，对细胞来源、汗青培育情况、平安性等方面需要成立办理尺度和量控系统，进一步增加了NK细胞产物的报批难度。

（2）纯因子培育工艺（Feeder-Free）

该类培育工艺利用IL-2、IL-12等细胞因子刺激，向NK细胞标的目的诱导或激活，同时共同响应的细胞培育基，使NK细胞大量增殖。该类培育工艺的长处在于平安性，其所用的细胞因子在体内本来存在，整个培育过程相当于在体外模仿体内情况。因为无活细胞成分，较添加滋养细胞的培育办法而言，降低了产物报批难度。但是纯因子培育手艺的消费效率较低，在培育过程中需要消耗大量的细胞因子，细胞因子研发成本及价格都很高，所以招致该类工艺的消费成本居高不下；别的，该类工艺所收成的NK细胞纯度不及添加滋养细胞的培育工艺，存在脱靶效应，杀伤效果偏弱。

差别来源的NK细胞造备体例有所区别，但是大致造备过程不异：

（1）CAR构造的设想、NK细胞造备；

（2）NK细胞的扩增、CAR转导，以造备CAR-NK；

（3）CAR表型判定和免疫分型的研究；

（4）CAR-NK 的扩增和功用阐发；

（5）成立动物模子停止临床前的体内评价。

在CAR-NK细胞的造备过程中还应留意，⽆论是外周⾎仍是脐带⾎，在⽣产的前期过程中都需要进⾏细胞分选，有效去除T细胞、B细胞以及残留的髓系细胞，包罗CD4+和CD8+T；CD19/CD20+B细胞；CD33+细胞等，以包管NK细胞体外扩增的效率、细胞活性，以及制止异体移动物给患者带来的严峻的毒副做⽤等。

CAR-NK消费过程

3、CAR-NK细胞疗法优势与难点

3.1、CAR-NK疗法的优势

（1）平安性高

CAR-NK细胞免疫疗法比CAR-T细胞免疫疗法具有更好的平安性。CAR-T细胞免疫治疗的次要副感化之一是因为CAR-T细胞的持续存在而产生的靶向效应。相反，因为CAR-NK细胞细胞寿命短，阐扬感化后即消逝，制止了活化细胞在体内存在时间太长而杀伤一般组织。此外NK细胞不排泄IL-1，IL6等炎症因子，而是产生IFN-γ和粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），使得由CAR-T细胞排泄的促炎性细胞因子如INF-γ、TGF-α、IL-1和IL-6因子等诱导的细胞因子风暴（CRS）发作风险降低。同时同种异体NK细胞输注耐受性优良，不会引起移动物抗宿主病（GVHD）和明显的毒性。

（2）广谱抗癌

NK细胞不需要肿瘤特异性识别，且不会被细胞外表的次要组织相容性复合体（MHC）按捺活性限造。除了通过单链抗体识别肿瘤外表抗本来按捺癌细胞外，NK细胞还能够通过多种受体识别各类配体来按捺癌细胞，例如天然细胞毒性受体（NKp46、NKp44和NKp30）、NKG2D和DNAM-1（CD226）。那些NK细胞受体凡是识别在免疫细胞或持久治疗压力下肿瘤细胞上表达的应激诱导配体。此外，NK细胞还可通过CD16介导的ADCC机造肃清肿瘤细胞。临床试验表白，CAR-T细胞不克不及消弭高度异量性的癌细胞，但是CAR-NK细胞可以有效地杀死持久治疗后可能改动其表型的残留肿瘤细胞。

（3）对实体瘤疗效好

目前CAR治疗的一个次要障碍是缺乏对实体瘤的疗效，那是因为肿瘤灌注不良、TAA异量性和实体瘤伴发的免疫按捺肿瘤微情况（TME）所致。因为肿瘤微情况中PD-1的表达，CAR-T细胞的功用遭到按捺，但NK细胞排泄PD-1的程度较低，免疫按捺感化较小。

（4）容易造备

NK细胞在临床样本中十分丰硕，能够从外周血（PB）、脐带血（UCB）、人类胚胎干细胞（HESC）、诱导多能干细胞（IPSC）和NK-92细胞系中产生。此中iPSC的造备需要种子细胞少，可大量培育，成本较低，可实现自体供应，免疫原性较低，而NK92细胞系可无限增殖，对冻融敏感性较低。

（5）可做为通用即用（Off-the-Shelf）产物。

基于NK细胞的高平安性，NK细胞疗法的一个庞大价值在于可做为通用即用产物，适用于差别个别、可持久冻存，能为危重患者供给及时的治疗，同时还能有效降低消费成本和末端售价，进而降低患者公费以及医保付出压力。

3.2、CAR-NK疗法次要问题

（1）NK细胞的获得和体外扩增

起首，NK细胞治疗需要完全肃清T细胞，以制止GVHD。其次，NK细胞的半衰期大约为7～10 天，因而 CAR-NK 细胞治疗计划往往需要培育大量的NK细胞回输病人。单个供体的NK细胞数量不敷以停止治疗，那使得NK细胞的扩张和激活变得十分关键。那一消费过程凡是需要两到三周的时间来培育NK细胞和某些细胞因子。虽然辐照过的K562-mb15-4-1BBL细胞做为饲料能够改善NK细胞增殖过程中细胞的生长，但供体细胞数量的可用性仍然是一个障碍。

（2）将CAR转到NK细胞

选择适宜的办法将CAR转到NK细胞是CAR-NK细胞免疫治疗的关键。到目前为行，病毒载体和非病毒载体都被用来转化CAR。固然逆转录病毒载体的转染效率很高，但它可能会引起插入突变、致癌和其他不良反响。而慢病毒载体虽然显示出较低的插入突变发作率，但其对外周血NK细胞的转染效率低至20%。睡美人系统已应用于CAR-T，但对CAR-NK构造的能否适用尚不清晰。mRNA转染CAR-NK细胞也被认为是一种平安、适用的转染办法，然而通过电穿孔办法转染mRNA的CAR-NK细胞的抗肿瘤感化将是暂时的，因为CARs的表达程度不会超越3天。

（3）NK细胞的保留

NK细胞对冻融过程敏感，解冻后NK细胞的存活率和细胞毒性显著降低。若是参加IL-2，则能够部门恢复冷冻NK细胞的活性。为了使细胞冷冻保留成为可行的更佳战略，必需对冷冻NK细胞停止摸索。

（4）NK细胞的低耐久性

在缺乏细胞因子撑持的情况下，输注细胞缺乏体内耐久性是过继NK细胞治疗的次要缺点之一。固然进步了平安性，但也会限造NK细胞免疫治疗的效果。外源性细胞因子被证明能增加过继性NK细胞的增殖和耐久性，但也可能招致包罗按捺性免疫亚群的生长如Tregs的副感化。

（5）NK细胞归巢到肿瘤部位的效率

快速归巢到肿瘤床关于过继性细胞治疗效果至关重要，而且受NK细胞和肿瘤细胞释放的趋化因子之间复杂彼此感化的控造。然而，NK细胞归巢到肿瘤部位的效率不断存在争议。为了进步实体瘤患者NK细胞免疫治疗的胜利率，在小鼠模子中研究了几种促进NK细胞向肿瘤部位转运的新手艺，例如用编码趋化因子受体CCR7的mRNA电穿孔NK细胞，以增加向表达趋化因子CCL19的淋凑趣的挪动。然而，那些办法的有效性还需要在临床试验中停止验证。

（6）免疫按捺肿瘤微情况

肿瘤微情况（TME）包罗免疫按捺分子、免疫按捺细胞和阻碍免疫细胞功用的倒霉情况，是CAR-NK细胞治疗的次要障碍。TGF-β、腺苷、吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）和前列腺素E2（PGE2）是TME中发现的可损害NK细胞活性的免疫按捺细胞因子和代谢物。Treg细胞、调理性B细胞、髓源性按捺细胞、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和一些倒霉的代谢因素，如缺氧、酸度和营养缺乏，在恶性情况中会招致免疫按捺。同时TME还能通过免疫查抄点分子招致NK细胞耗竭。

3.3、CAR-NK与CAR-T比照

CAR-TCAR-NK移动物抗宿主病（GVHD）风险凹凸杀瘤潜力高高肿瘤杀伤路子少多细胞因子释放综合征的风险凹凸移动物抗肿瘤效应（GVT）潜能低高癌症免疫治疗成本高较低细胞来源少多起效速度慢快临床药效凹凸耐久性凹凸传染风险较低高消费难度易获得但需大量革新扩增难

3.4、CAR-NK用于实体瘤现状

（1） CAR-NK疗法的多抗原测验考试

虽然细胞免疫疗法开拓了治疗血液系统恶性肿瘤的潜力路子，但那些功效迄今尚未胜利转移到实体瘤的治疗中。除了 CAR-NK 免疫疗法的内在挑战（例若有限的体内耐久性和功用衰竭）之外，实体瘤对基于细胞的治疗战略构成了一系列奇特的挑战，包罗其复杂的克隆异量性、与安康组织共享的抗原表达以及固有的敌对免疫按捺微情况。此外，实体瘤已经进化出下调其外表可以活化NK细胞配体的机造，以到达免疫逃避的目标，而且能够有效地削弱免疫细胞向肿瘤床的运输。

虽然存在那些挑战，但在针对多种抗原，如：HER2、PSMA、间皮素、MUC1、NKG2D和 ROBO1的多项目前正在停止的早期研究中，人们越来越存眷利用细胞疗法匹敌实体瘤。

（2）基因工程改善CAR-NK归巢效应

为了实现有临床意义的抗肿瘤反响，并使工程细胞疗法普遍用于治疗实体瘤，设想下一代CAR-NK疗法时，需要加强向肿瘤床的迁徙以及进步穿透实体肿瘤屏障的才能。几个研究小组目前正在研究NK趋化因子受体的基因润色，使NK细胞更有效地归巢到肿瘤部位。

在肾细胞癌中，颠末润色以表达超心理程度 CXCR2 的NK细胞表示出向疾病表示部位的运输改善。类似地，在EGFRvIII诱导的CAR-NK细胞上强迫表达趋化因子受体4 （CXCR4）能够进步胶量母细胞瘤动物模子的存活率。已有研究团队在靶向NKG2D配体的CAR中检测了CXCR1的异位表达，并在小鼠腹膜卵巢癌模子中证明了免疫细胞浸润的改善和抗肿瘤成效的加强。

（3）双或多特异性靶向

许多血液系统恶性肿瘤素质上是单克隆或寡克隆疾病，而实体肿瘤的特征是具有高度异量性的复杂克隆形态。单一抗原定向细胞疗法在匹敌由多个共进化克隆驱动的异量肿瘤时面对严重障碍，每个克隆都有其奇特的免疫表型和抗原表达形式。用于匹敌实体肿瘤的细胞根底治疗还必需解开肿瘤和安康组织之间共享抗原表达的复杂性，以制止无意中误伤和非肿瘤毒性。

双或多特异性靶向是新的打破点，那能够减轻实体瘤异量性和共享抗原表达带来的挑战。在设想治疗高难治性疾病的研究中，NK-92衍生的NK细胞装备了对野生型EGFR和EGFRvIII均具有特异性的双特异性CAR构建体。当打针到两种差别的GBM异种移植模子中时，双靶向 CAR-NK 细胞有效地按捺了肿瘤的生长并进步了保存率，而不依赖于EGRF突变形态。

2021 岁首年月，Jeffrey Miller 的小组介绍了他们在多特异性现成B7-H3靶向 iPSC来源的CAR-NK细胞的部门功效，该细胞能够识别多种实体瘤。B7-H3（CD276）是B7卵白超家族的成员，在多种肿瘤中上调，出格是在转移性情况中，而且与预后不良有关。除此之外，该研究团队还在体外检测到针对卵巢癌、前列腺癌、骨癌和乳腺癌细胞株的强细胞毒性信号。那对做为泛癌抗原具有显著的吸引力。

3.5、CAR-NK细胞的手艺迭代

CAR的细胞内激活信号的数量是CAR-NK手艺迭代的次要标记。

研究显示CD3ζ，4-1BB在NK细胞和T细胞上能够通用，而DAP10，DAP12和2B4 是特异的NK细胞激活信号。第一代CAR-NK细胞与CAR-T细胞一样，只含有CD3ζ信号。第二代和第三代CAR-NK别离照顾一个和两个额外的共刺激信号，共刺激分子凡是来源于CD28家族（CD28和ICOS）、TNFR家族（4-1BB、OX40和CD27）或SLAM相关受体家族（2B4）。目前公布的一项CAR-NK临床试验接纳了第二代CAR-NK构建，该构建通过参加IL-15表达和诱导Caspase9加强活性。

目前大大都CAR构造依赖于CD3ζ链信号域，强烈的激活信号关于诱导有效的抗肿瘤反响很重要，但也可能招致效应细胞的快速衰竭。因而共刺激域的组合可用于校准所需的免疫细胞反响。与基于4-1BB的CARs比拟,基于CD28的CARs表示出更快的效应器特征，诱导更高程度的IFN-γ、颗粒酶B、TNF-α。但那种强烈的共刺激信号也会招致活化诱导的细胞灭亡（AICD）。比拟较，4-1BB-CD3ζ信号优先诱导记忆相关基因和持续的抗肿瘤活性。原因可能是4-1BB构造域改善了CD28构造域引起的T细胞耗竭。

CAR手艺的迭代

在CAR-NK细胞系和原代CAR-NK细胞的研究中，CD3ζ几乎被遍及用做次要的激活域，此中大约一半照顾一个额外的激活域，凡是添加4-1BB或CD28。在第三代构造中，CD28/4-1BB/CD3ζ的组合是最常用的。

.CAR-NK手艺迭代

3.6、CAR-NK疗法的临床研究

在美国更大的临床试验数据库（http://ClinicalTrials.gov）上共有25个有关CAR - NK临床试验，大部门处于1/2期临床试验阶段。针对液体肿瘤和实体肿瘤的试验别离为16项和8项，此中13项试验来自中国，5项来自美国。从靶点来看，与CAR-T类似，大都CAR-NK细胞治疗产物靶向的是常见的恶性血液癌症靶点，如CD19（7）、BCMA（3）、CD33（3）等。还有一些CAR-NK产物靶向的是实体肿瘤相关抗原，如PSMA（1）、间皮素（1）、ROBO1（1）、NKG2D（2）等。就病种来看，B淋巴瘤（8）、髓系白血病（5）和骨髓癌（3）的相关研究数量最多，在实体瘤中结曲肠癌（2）的研究较为炽热。临床试验同样测验考试了将CAR-NK与抗体类药物如PD-L1，PD-1和ant-CD20单抗停止联用；与化学类药物如氟达拉宾、环磷酰胺、卡莫司汀、阿糖胞苷、依托泊苷、非格拉斯汀和美法仑等停止联用。

在研究的靶标方面，Her2是实体瘤最常用的靶点，而CD19抗原在血液肿瘤中最常见。利用原代NK细胞的研究中，65%的人在研究B细胞恶性肿瘤，CD19是更受欢迎的靶点。而在利用NK细胞系的研究中，研究实体瘤是血液恶性肿瘤的2倍以上。

四、CAR-NK 疗法财产阐发

4.1、国内市场规模

2022年2月，国度癌症中心发布最新一期的全国癌症统计数据，查询拜访显示2016年中国癌症新发病例406.4万，此中实体瘤占绝大大都。实体瘤中，新增肺癌人数82.8万，结曲肠癌人数40.8万，胃癌人数39.7万，肝癌人数38.9万，乳腺癌人数30.6万。在血液瘤中，新增最多的是淋巴瘤，人数到达了9.0万，其次是白血病，人数为8.6万。

固然现行的CAR-T疗法对血液瘤效果显著，但是对实体瘤效果较差。新增人数最多的癌症前10位灭亡约占全数恶性肿瘤灭亡病例的83.00%。而上述肿瘤大都为实体瘤，实体肿瘤匹敌原依赖型的NK细胞较为敏感，颠末继润色的CAR-NK匹敌实体瘤的优势更为明显，有望成为匹敌实体肿瘤的新希望。若是根据每例患者费用30万人民币计算，2020年全球新发癌症病例1929万例，中国新发癌症患者457万，CAR-NK药物按 1% 占有率，每年治疗4.57万患者，仅中国营收可到达137亿人民币，全球营收可到达2000亿人民币。

4.2、国表里相关政策

全球关于细胞疗法的相关政策逐步从促进向监管过渡，目前，全球良多兴旺国度均将细胞疗法做为医药范畴重点撑持和开展的标的目的，同时，我国也造定了一系列加快生物医药财产开展的方针和政策，以满足广阔患者对新手艺、新疗法的迫切需求。

2016年2月，美国国度细胞造造协会（NCMC）颁布发表了《面向 2025年大规模、低成本、可复造、高量量的细胞造造手艺道路图》，此道路图以及更新文件关于此后细胞治疗大规模造造手艺的开展具有重要指点意义。

欧盟的 EMA 发布了专门的文件将基因革新后的细胞归类为“医疗产物”（Medical Products）。欧洲药品办理局（EMA）于2020岁尾发布《基因润色细胞医学产物量量、非临床和临床指点原则》，此中包罗CAR-T详细研发内容。通过政策性文件逐步标准行业可能会产生的不良影响。

目前中国关于细胞治疗接纳“双轨造”：一种轨道是将细胞疗法产物做为药品办理， NMPA及其部属部分对临床试验以及产物注册停止监管审批；另一种轨道则是将细胞疗法做为医疗手艺办理，由国度卫生安康委员会（National Health Commision, NHC）及其部属部分停止监管审批，准予在医疗机构实现临床手艺应用。

2019年3月，NHC发布了《体细胞治疗临床研究和转化应用办理法子（试行）》收罗定见稿，该法子表白对体细胞临床研究停止存案办理，并允许临床研究证明平安有效的项目颠末存案在相关医疗机构进入转化应用。比拟药品注册，医疗手艺存案更为简单快速，由此也吸引研发机构与医疗机构结合开展研究者倡议的临床试验（Investigator-Initiated Trial, IIT）。

2019年4月，中国国度药品监视办理局启动中国药品监管科学动作方案，“细胞和基因治疗产物手艺评价与监管系统研究” 为首个纳入的重点项目；2020 年 9 月相继发布 2 份细胞和基因治疗的手艺原则和 1 份利用东西指南，并公开收罗定见，通过政策刺激国内相关市场逐步走向成熟。 此外，还有越来越多的政府参与此中，并做为关键的根底设备和办事的撑持力量。例如，2018 年，英国细胞与基因疗法造造中心 （CGT Catapult） 正式揭牌，该中心是由英国政府财产战略基金投资成立的，投资金额超越 6000 万英镑，办事于全球敏捷开展细胞与基因治疗财产。

2021年2月和12月，NMPA药品审评中心（Center for Drug Evaluation, CDE）别离发布了《免疫细胞治疗产物临床试验手艺指点原则（试行）》和《基因润色细胞治疗产物非临床研究手艺指点原则（试行）》那两部手艺指点原则，别离对免疫细胞治疗产物和基因润色细胞治疗产物的开发做了标准。2021年2月，NHC在官网上发布了《对十三届全国人大三次会议第4371号建议的回答》，回答函中明白提出：“我委不断鼓舞和撑持干细胞、免疫细胞等研究、转化和财产开展。干细胞、免疫细胞等细胞造剂具有明显的药品属性。国度药品监管部分已经为相关造剂通过药品审批造定配套政策，审批后能够敏捷普遍应用，既有利于保障医疗量量平安，又有利于财产化、高量量开展。”2022年1月，NMPA发布《药品消费量量办理标准-细胞治疗产物附录（收罗定见稿）》和《嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗产物申报上市临床风险办理方案手艺指点原则》两项与细胞治疗产物亲近相关的律例。

基于以上一系列政策和定见的颁布，将细胞疗法产物做为药品办理“似乎”更契合我国监管的开展标的目的，也许在将来可能从“双轨造”变成以药品办理的“单轨造”，与以美国、欧盟为代表的国际支流做法接轨。

NK细胞与T细胞均为免疫细胞，由此NK细胞疗法能够模拟CAR-T的注册途径，根据新药体例在国内注册申报。2021年11月11日，CDE批准了第一款我国自主研发的针对“晚期上皮性卵巢癌治疗的靶向间皮素（Mesothelin，MSLN）嵌合抗原受体NK细胞（CAR-NK）打针液”的临床试验申请。

4.3、国外领先药企

（1） Nkarta

Nkarta成立于2015年，总部位于美国加利福尼亚州南旧金山，是一家生物造药公司。该公司努力于开发细胞疗法，以治疗各类血液系统疾病和实体肿瘤。Nkarta将其NK细胞扩增手艺与专业细胞工程手艺相连系，消费大量NK细胞，并进步其对肿瘤靶标的识别精度，以到达癌症治疗目标。Nkarta还方案基于NK细胞疗法开发候选药物，以改善患者治疗效果。

2020年7月，Nkarta登岸纳斯达克（NKTX）。2020年11月12日，Nkarta颁布发表其次要候选产物NKX101靶向NKG2D的CAR-NK疗法, 用于治疗复发/难治性急性髓系白血病（r/r AML）或高风险骨髓增生异常综合症（MDS）。除了NKX101，该公司还有一条CAR-NK 细胞疗法研管线NKX019，靶向CD19，用于治疗B细胞淋巴瘤。

Nkarta Therapeutics在2022年4月颁布发表了旗下两款CAR-NK细胞疗法候选产物NKX101和NKX019在差别的血液恶性肿瘤中停止独立剂量研究的最新临床数据。值得留意的是，两个项目都在评估15亿x3剂量CAR-NK细胞的更高剂量计划。

NKX101在急性髓细胞白血病（r/r AML）和骨髓增生异常综合征（MDS）的治疗中，高剂量组5名AML患者中3名获得完全缓解（60% CR），此中2例CR病例的最小残存病灶（MRD）转阴。

.NKX101临床活性评估

NKX019在6名复发/难治性B细胞恶性肿瘤（NHL）患者中，高剂量组6名患者中5名获得了部门缓解（83% ORR），此中3名获得了完全缓解（50% CR），CR病例中还包罗一名侵袭性洋溢大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者和一名套细胞淋巴瘤（MCL）患者。

.NKX019临床活性评估

平安性方面，两个项目均未陈述剂量限造性毒性，也未在任何剂量下察看到细胞因子释放综合征、神经毒性或移动物抗宿主病。

（2） NantKwest

NantKwest，成立于2002年，总部在美国加州，原名Conkwest，上市前改为现名NantKwest。NantKwest是努力于开发NK细胞疗法的免疫治疗公司。其次要产物有三大系列：高表达CD16受体的haNK细胞产物、高表达特异性CAR的taNK细胞产物以及连系两者优势的t-haNK细胞产物。目前haNK全线产物均已进入Phase Ib/II 临床试验阶段。

时间事务2019年3月NantKwest与ProMab Biotechnologies签订协议，开发针对多发性骨髓瘤的CAR-NK疗法。2019年6月26日PD-L1 t-haNK新药临床试验申请（IND）已获得FDA批准。2020年12月21日NantKwest与ImmunityBio颁布发表达成全股票合并协议，旨在连系NantKwest的NK细胞平台与ImmunityBio的免疫疗法交融卵白、免疫调理剂和腺病毒平台，开发针对癌症和传染性疾病的新一代免疫疗法。2021年1月颁布发表了 PD-L1和t-haNK 与免疫疗法公司 ImmunityBio的IL-15结合治疗转移性胰腺癌的数据，在 11位承受治疗的受试者中，前10位得到了部门缓解，最初一位患者得到了完全缓解。NantKwest在研管线3.3.3 Fate

（3）Fate

Fate Therapeutics, Inc.创建于2007年，总部位于美国加州San Diego，是一家临床阶段的生物手艺公司，在全球范畴内开发用于癌症和免疫疾病的法式化细胞免疫疗法。Fate Therapeutics专攻于工程化的NK细胞，治疗血液瘤/肿瘤，及其它免疫性疾病。公司的NK细胞来源于公司专利平台手艺产生的iPSC细胞，基于该平台，Fate公司成立了普遍的现货型细胞疗法产物管线，此中次要包罗iPSC来源的CAR-T、CAR-NK和NK细胞等疗法，正在血液肿瘤和实体瘤中停止摸索。目前已有多款iPSC衍生细胞疗法处于临床阶段。公司专利的iPSC平台不单可消费具有无限扩增及分化潜力的CAR-NK细胞，并且有望大幅降低NK细胞的消费成本。公司的一项消费周期为44天、规模300剂（FT500）的GMP消费数据显示，每剂CAR-NK的成本约3000美圆，出厂价为2-3万美圆，较CAR-T细胞疗法近40万美圆的费用大幅降低。

.基于iPSC平台的iPSC衍生细胞疗法以及NK细胞疗法

Fate公司的FT516的设想就是基于NK细胞的ADCC体例，将NK细胞安拆一个高亲和力，不成切割的CD16Fc受体（158V），放大ADCC。从phase I 临床研究设想上看，FT516的现货治疗计划包罗了两个周期中的应用，每个周期包罗三天的预处置化疗（500mg/m2环磷酰胺和30mg/m2的氟达拉滨）、单剂量的利妥昔单抗（375mg/m2）和每周3次的FT516剂量（在第1、8、15天输注），每种剂量均需要IL-2细胞因子撑持。后续临床陈述显示，可研究的11名患者中有8名到达了客不雅缓解，此中6名患者到达了完全缓解，ORR为73%。那11名患者中有8名患有侵袭性B细胞淋巴瘤，此中4名患者之前承受过自体CD19 CAR-T细胞治疗。此中一例患者，对所有先前的疗法均无效，在承受FR516的第一个治疗周期后，患者获得了完全缓解，目的部位病变的大小削减了85%，显示出了显著的治疗效果。

在此根底上，Fate公司推出别的一款产物FT596。FT596是一种研究性的、通用的、现成的CAR-NK细胞癌症免疫疗法，针对NK细胞生物学优化的专有CAR，FT596靶向B细胞抗原CD19，颠末润色以加强其与肿瘤靶向抗体的连系，并促进加强NK细胞活性的IL-15交融受体(IL-15RF)。所以迭代的CAR-NK（FT596）靶向性和活性更强。目前，临床试验正在评估单剂量FT596做为单药治疗（单药治疗组）和三天后与单剂量利妥昔单抗（375 mg/m2）（结合治疗组）的疗效评估。与此同时，FATE起头规划针对多发性骨髓瘤的CAR-NK，加拆CD-38和BCMA相关分子的产物。

2022年1月12日，美国食物药品监视办理局（FDA）最新批准Fate“现成”的、iPSC衍生的CAR-NK候选产物FT536的研究性新药（IND）申请。

(4) Catamaran

2020年11月25日，总部位于马萨诸塞州的Catamaran Bio（下称Catamaran公司）颁布发表成立。 Catamaran公司努力于开发新型CAR-NK细胞疗法，用于治疗包罗实体瘤在内的多种癌症。公司专有手艺平台TAILWIND能够实现对NK细胞的革新，按照公司官网的介绍，TAILWIND平台具有三点优势。

起首，目前CAR-NK疗法中利用的CAR构造不克不及更佳地参与NK细胞内信号通路，招致癌细胞杀伤效果较差。Catamaran公司通过设想NK细胞特异性的CAR构造，能够更好的激活NK细胞，加强癌细胞杀伤感化。其次，肿瘤微情况（TME）的存在影响了免疫反响的有效性和耐久性。Catamaran公司通过合成生物学的办法，为CAR-NK细胞设想了新的生物学特征，使得细胞能够更好的感知和克制TME中的免疫按捺信号。除此之外，在利用病毒载体向CAR-NK细胞递送有效载荷时，无法递送分子量大的有效载荷。Catamaran公司通过利用转座子系统的办法处理了那一问题。基于之前的工做，Catamaran公司目前有两款CAR-NK在研产物，均用来治疗实体瘤，本次融资也将用来推进那两款在研产物的研究。Catamaran正在操纵其TAILWIND平台，用于工程、加工和造造NK细胞，并快速推进其同种异体CAR-NK细胞治疗产物管线。

.Catamaran的管线

CAT-248是Catamaran通过其TAILWIND™平台开发的一款同种异体的CD70靶向的CAR-NK细胞疗法。CD70在血液瘤与实体瘤中均有表达，但外周血NK细胞中不会天然表达，但可通过激活上调。

2021年12月16日，Catamaran Bio在第63届美国血液学年会（ASH）上以海报形式展现了该“现货”型CAR-NK细胞疗法的临床前成果。

（5）Senti Bio

Senti Bio成立于2016年，总部位于美国加利福尼亚州，由合成生物学大牛、MIT生物工程学和计算机科学副传授卢冠达（Timothy K. Lu）等人所创建的细胞疗法公司，是一家专攻人体细胞革新的生物手艺公司。以治疗最复杂和更具挑战性的疾病为任务，Senti Bio操纵合成生物学设想“基因电路”治疗肿瘤及癌症疾病。

Senti Bio的明星候选产物包罗SENTI-202 、 SENTI-301，及其他未公开的实体瘤靶标候选物。操纵OR + NOT门控手艺，SENTI-202旨在精准靶向复发/难治性AML（异量急性髓系白血病）细胞，包罗促进癌症复发的关键白血病干细胞，同时避免对安康血液干细胞形成损害。SENTI-301为复发/难治性HCC（肝细胞癌）的治疗供给了一种革命性的新办法。操纵表达组合免疫效应载荷的基因电路，SENTI-301能有效加强NK细胞活活性，进步抗肿瘤成效。

在2022年美国癌症研究协会（AACR）年会上该公司公布了其CAR-NK细胞疗法在实体瘤治疗上的临床前数据。该数据显示，利用基因电路的逻辑门革新的CAR-NK细胞疗法能够进步同种异体CAR-NK细胞治疗实体瘤效果的潜力。而且配备校准释放IL-15（crIL-15）的CAR-NK细胞实现了更佳的细胞因子散布，并具有超卓的杀伤力和耐久性。

4.4、国内代表企业

公司成立时间所在田主要产物星奕昂2021上海专注于iPSC-CAR-NK通用现货型可量产化的免疫细胞产物的开发和应用。国健呈诺2019北京针对“晚期上皮性卵巢癌治疗的靶向间皮素（Mesothelin，MSLN）嵌合抗原受体NK细胞（CAR-NK）打针液”。博生吉医药2010苏州专注于开发具有国际领先程度的打破性First-in-class和Best-in-class CAR-T细胞药物，已有多个细胞产物进入POC临床验证阶段，涵盖大部门血液肿瘤和部门实体肿瘤。启函生物2017杭州研发了iPSCs的“Super NK细胞”，具有成为下一代异体细胞治疗产物的庞大潜力。昕传生物2021北京重点规划通用现货型免疫细胞疗法，基于其全方位立异的iPSC-CAR-免疫细胞疗法与类器官高通量挑选手艺，围绕肺癌、肝癌、肠癌、B淋巴细胞瘤等高发癌症，昕传生物已完成多款iPSC-CAR-NK产物管线规划。优凯瑞2019杭州与河北燕达陆道培病院开展CAR-NK临床研究项目。传奇生物2014南京开发了一个稳健的NK 消费工艺，包罗以下功用：稳健的扩增和CAR转导过程；高纯度高抗肿瘤活性 CAR-NK 产物的消费；优化超低温保留工艺，更大限度地削减解冻后活力和功用的丧失。恒润达生2015上海针对实体瘤的新靶点CAR-T、TCR-T、CAR-NK和溶瘤病毒等立异管线产物的研发。英百瑞2014杭州开展了一项针对部分晚期或转移性实体瘤的临床试验在上海同济大学从属东方病院及上海阿特蒙病院正式启动。景达生物2015北京与北京五加和基因科技有限公司签订战略合做协议，颁布发表在NK/CAR-NK细胞基因药物研发方面展开深度战略合做。河络新图2021南京倾力打造2个立异平台，包罗通用型细胞治疗平台，连系iPSC定向分化的NK细胞和基因编纂开发iNK细胞治疗手艺（CAR-iNK），研发管线将笼盖血液和淋巴系统肿瘤、实体肿瘤和神经系统相关疾病。