CRISPR代表"Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats"（成簇规律性间距短圣塞雷县反复字符串）。II型原核生物CRISPR“免疫控造系统”的发现，使得可以开发简单、机能强大、快速施行的RNA辅导的DNA组撰稿辅助东西。CRISPR第一个字母缩写一般来说发音为“ crisper”。
CRISPR / Cas核酸RNA激酶的DNA组撰稿www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/technical-documents/protocol/genomics/advanced-gene-editing/crispr-cas9-genome-editing?utm_campaign=SEO%20-%20China&utm_medium=zhihu&utm_source=article&utm_content=425401695
CRISPR / CAS接纳哪种工做根本原理？
CRISPR通路在病菌中被发现，其机能很像免疫控造系统，能抵御侵略的病原体和核酸DNA。来自侵略病原体的短DNA字符串（间距区）掺入病菌DNA组内的CRISPRDNA残基，并充任先前病毒传染的“记忆”。再病毒传染引发互补的成熟CRISPR RNA（crRNA）以找到婚配字符串 — 其为CRISPR相关（Cas）核酸供给更多特异性，以在某一 “马尿酸” DNA字符串处逐渐构成单爆仓。
图 1.DNA组标靶残基
CRISPR CAS9接纳哪种工做根本原理？
为了成立如许的辅助东西，CaroniCRISPR有效路子被简化为三个次要组分：Cas9核酸和辅导RNA（gRNA）1-7。导向RNA是由crRNA和tracrRNA构成的钠和钾控造系统。crRNA抗肿瘤待研磨的单链DNA，因而具有短的相混区域，允许其慎密连系tracrRNA。 tracrRNA供给更多与Cas9卵白量慎密连系的茎环构造。crRNA:tracrRNA单链体被称为gRNA。 Cas9核酸和gRNA逐渐构成Cas9核苷糖卵白量（RNP），能在整个DNA组情况中慎密连系并研磨某一的DNA标靶。为了被RNP研磨，靶必需具有三个某一字符串。起首，gRNA需要17-21个核苷酸的RNA至DNA相混性，那被称为前间距字符串。 其次，Cas9卵白量需要有一个短的前间距字符串临近repeats（PAM），以慎密连系靶DNA（拜见图2）。 若是存有相连tracrRNA，因而在gRNA和DNA组标靶之间存有足够的相混性，则RNP研磨靶DNA的两条链，在DNA组中的该切确边线处形成DSB。
图 2.CRISPR / Cas抗肿瘤单爆仓的示企图。
固然细胞核核中的机能性CRISPR是RNP形式，但做为大分子辅助东西的CRISPR的组件合适于各类寄送办法。 早期尝试胜利地成立了genomes单辅导RNA或sgRNA，其将crRNA和tracrRNA组合成一般而言RNA链而不是天然存有的单链体。 该sgRNA和Cas9 mRNA能从一般而言核酸抒发，用做间接HIAA或包拆成用做慢病原体implantation的颗粒。 也可将重组Cas9卵白量与合成形成的crRNA和tracrRNA组合，以生成RNPHIAA或显微打针给胚胎。
抗肿瘤DSB逐渐构成后，细胞核一般来说利用两种DNA复原有效路子中的一种来存活：非相混末端相连（NHEJ）或相混依赖性复原（HDR）。那些复原监视机造时常会手忙脚乱，引致在靶边线生物进化，或者透过毁坏编码字符串来机能性地凋亡或卢瓦龙县DNA（NHEJ），或者透过添加捷伊DNA字符串来源文件某一的字符串变革（HDR）。透过那种体例，CRISPR / Cas9控造系统可以对染色体DNA停止永久的、可遗传的润饰。此外，当Cas9核酸具有特征酶亚基凋亡并附着于其他效应大分子以感化做DNA组中的gRNA指定残基时，CRISPR控造系统可用做抗肿瘤寄送控造系统。 那将CRISPR控造系统机能扩展到DNA转化成和减缓。最初，CRISPR控造系统可用做甄选。CRISPR / Cas9控造系统的DNA卢瓦龙县、DNA源文件、DNA转化成或减缓、以及甄选那所有四种次要用处将鄙人面进一步讨论。
DNA卢瓦龙县
当与抗肿瘤DNA特异的gRNA一路贝叶斯时，CRISPR / Cas9形成卢瓦龙县细胞核或基因工程。DNA卢瓦龙县的目地是透过毁坏其在细胞核中的抒发来提醒DNA机能。贝叶斯的恰当设想的gRNA辅导Cas9研磨靶字符串，并在目地DNA中形成DSB。然后能透过三种体例中的任何一种实现DNA卢瓦龙县：1）细胞核透过NHEJ复原脱落，引致研磨DNA的开放阅读框（ORF）内的随机填入或缺位（“填入缺位”）；2）细胞核透过HDR从用户供给更多的模板复原脱落，将某一的毁坏性字符串填入ORF中；3）一对gRNA形成三个DSB，其位于根本编码字符串的侧翼，引致其切除。
NHEJ是最活泼的复原监视机造，但是容易手忙脚乱，因而时常引入aes，引致过早末行核苷酸和/或引致所得转录物成为无义激酶的衰变（NMD）的标靶。aes润饰可引致过早末行核苷酸被引入转录物，阻遏氨基酸链的关键部门被翻译，引致异常短的无机能卵白量量。无义激酶的衰变透过消弭含有过早末行核苷酸的mRNA转录物来削减DNA抒发中的错误。 理论上，当外显子-外显子相连复合物（也就是RNA剪接期间在外显子之间的前mRNA链上逐渐构成的蛋白量复合物）在转录物被剪接后未被核苷体恰当地去除时，那个监视有效路子被转化成。当外显子-外显子相连复合物因为上游aes而连结慎密连系时，转录物被指示降解，因而机能卵白量量从未被翻译。那两种有效路子都有效毁坏细胞核中的DNA机能。
DNA源文件
CRISPR / Cas9也可用做引入或“源文件”捷伊DNA字符串。常见的润饰包罗引入单核苷酸多态性（SNP）、小标签、loxP或更大的DNA盒，例如荧光卵白量。那些润饰是透过某一绺线的Cas9诱导的DSB停止的，那显著加强了抗肿瘤整合的时机。抗肿瘤整合（DNA源文件）透过HDR发作。为了透过HDR停止DNA撰稿，必需将含有所需字符串的DNA “供体” 或复原模板与gRNA和Cas9一路寄送至细胞核，一般来说在供体核酸或寡核苷酸上。DNA源文件的效率一般来说低于卢瓦龙县（<10％的润饰等位DNA），但可用做形成范畴从单核苷酸变革至大填入物的某一润饰。
DNA转化成和减缓
除了做为DNA组撰稿辅助东西之外，CRISPR还能用做其他机能卵白量的抗肿瘤寄送控造系统。Cas9的一个奇特特征是它可以独立于DNA研磨而慎密连系靶DNA，因为那是Cas9监视机造的三个独立步调。野生型Cas9具有三个核酸亚基：RuvC和HNH。为了在没有研磨的情况下实现慎密连系，透过诱导点突变（SpCas9中的D10A和H840A）使三个核酸亚基凋亡，引致核酸灭亡的Cas9（dCas9）。当与抗肿瘤转录起始残基的gRNA组应时，发现零丁的dCas9足以透过阻断转录起始来降低或减缓转录。在那一开展之后，科学家起头测验考试将转录减缓因子和转化成因子与dCas9联络起来。KRAB转录减缓亚基已经与dCas9交融，做为效应亚基激酶的转录缄默的形式。dCas9也与转录转化成因子和转录效应卵白量交融。用做转化成的dCas9是普遍流行的研究范畴，因而包罗诸如dCas9-VP64、dCas9_SunTag、dCas9-SAM、dCas9-RNA收架和dCas9-VPR的控造系统。 在我们的产物线中，我们将dCas9与人E1A相关卵白量P300的催化组卵白量乙酰转移酶（HAT）核心亚基交融。当与抗肿瘤转录起始残基和加强子区域的gRNA组应时，dCas9-P300辅导组卵白量乙酰化，从其异染色形态释放DNA，以透过天然染色体情况中的Caroni细胞核监视机造上调DNA抒发。dCas9-P300组卵白量乙酰化办法代表了相关于dCas9-VP64或其他类似DNA活化repeats的奇特感化监视机造。
甄选
甄选能快速查询拜访大量候选DNA或DNA组残基，以参与您的有效路子或感兴趣的表型。池化寡核苷酸消费和大数据处置的改良，加上慢病原体寄送的效率，使研究人员可以同时考虑数千个候选DNA，无论是做为文库仍是更为集中的子集（panel）。我们将文库定义为CRISPR克隆的全数DNA组集合；而子集（panel）则是较小的DNA子集。一般来说，子集（panel）和文库能以两种形式组拆：池化（在一个管中有数千个gRNA）或摆列（在96孔板中每个孔一个gRNA）。那两种办法都能快速地为更大的问题供给更多谜底，与过去的办法比拟具有明显的优势，过去的老办法需要一次一个地询问候选DNA，是一个费时吃力的过程。
我们供给更多多种甄选处理计划，包罗来自Broad的池化GeCKO文库，以及Sanger阵列全DNA组慢病原体CRISPR文库，以施行大型DNA卢瓦龙县甄选（8）。因而，人类和小鼠CRISPR / Cas9协同转化成调控子（SAM）池化文库亦即将推出，用做全DNA组甄选转录转化成表型！
CRISPR / CAS9是什么？
CRISPR / Cas9控造系统于1993年被发现，因而显示在病菌和古病菌生物体内进化，做为对病原体和外来核酸的防御。天然CRISPR有效路子的机能是将核酸抗肿瘤侵入性DNA，形成潜在致命的单爆仓（DSB）。在识别该有效路子的机能后不久，来自病菌化脓性链球菌（SpCas9）的II型CRISPR / Cas9控造系统被从头操纵以形成简单但强大的大分子辅助东西，其可被编程以将核酸抗肿瘤某一的DNA组字符串。
默克sigma aldrich为开发CRISPR/CAS9所做的奉献
我们很荣幸能为全球研究圈供给更多最捷伊CRISPRDNA组撰稿辅助东西。做为近十年来第一家贸易化供给抗肿瘤DNA组撰稿手艺的公司，我们那方面的专业常识业内难以匹敌。对DNA组撰稿辅助东西有某一抗肿瘤性和不变研磨活性关键要求时，那一经历尤为重要。我们在全新CRISPR产物线兼具那两种特征，现可透过我们快速简单的网页设想平台轻松获取。我们的CRISPR产物可透过下方链接间接订购，也可阅读此页面上的CRISPR内容领会有关该手艺的更多信息。
全机能即用型CAS9和辅导RNA（GRNA）抒发核酸
· 核苷酸优化的Cas9卵白量和gRNA从单一载体抒发，并做为即
用型HIAA级DNA供给更多。· 预先设想的奇特CRISPR残基可更大限度地削减脱靶，可用做人类、小鼠和大鼠DNA组的编码区域。可应要求随时供给更多任何其他区域或物种的定造设想（拜见定造CRISPR索取表）。
· GFP或RFP与2肽交融到Cas9的C末端，透过FAC分选跟踪HIAA效率和丰硕DNA组撰稿活动。
图 3.CRISPR/Cas单核酸形式
CRISPR配对暗语酶
· CRISPR配对暗语酶透过要求将三个零丁的gRNA独立慎密连系到部分DNA组区域，进一步最小化脱靶单爆仓。
· 在存有Cas9-D10A暗语核酸的情况下，三个gRNA在DNA的相反链上诱导单爆仓，形成机能性单爆仓。
· 预先设想的、奇特的CRISPR配对暗语酶可用做人类、小鼠和大鼠DNA组的编码区域（配对暗语酶预设想）。可应客户要求随时供给更多任何其他区域或物种的设想（拜见定造CRISPR索取表）。
· 当为某一靶订购Sigma的CRISPR配对暗语酶时，研究人员将获得三个零丁的即用型HIAA级核酸，抒发来自人U6启动子的gRNA。Cas9-D10A暗语核酸必需做为核酸或mRNA单另购置。
图 4.配对Cas9暗语酶
图 5.CRISPR Cas3
配对Cas9暗语酶 — 为获得更佳Cas9-D10A配对暗语酶机能，辅导RNA应设想为5至5标的目的，PAM间距为30至150 bp。
仅含纯化RNA的导向RNA
· 适用做显微打针或细胞核培育的纯化RNA形式的即用型gRNA。
· 利用与Sigma CRISPR和CRISPR配对暗语酶核酸不异的严酷规则所设想。
· CRISPR RNA格局是成立转DNA基因工程的研究人员或存眷DNA组核酸整合的研究人员的抱负选择。
· RNA形式制止了对某一启动子的需要，允许在大大都已知细胞核类型和生物体中抒发。
· 野生型Cas9（CAS9P）或Cas9-D10A暗语（CAS9D10AP）核酸必需做为核酸或mRNA（CAS9MRNA，CAS9D10AMRNA）单另购置。
· 可供给更多供体设想。
CRISPR慢病原体
· CRISPR慢病原体用做高效率的卢瓦龙县甄选
· 慢病原体形式允许停止CRISPR组分的有效染色体整合。
· 利用奇特的单一慢病原体CRISPR格局implantation细胞核，其具有侧翼为puro和GFP组件的Cas9 ORF，为监测不变细胞核群供给更多了多种选择。
· 即便在难以HIAA的细胞核中也能停止DNA组撰稿。
· 从我们预先设想的CRISPR残基选择或提交定造目的。
图 6.慢病原体CRISPR：(A) 全机能慢病原体CRISPR载体的载体图。(B) 用透过pLV-U6g-EPCG造成的颗粒implantationHEK293细胞核后的GFP信号。(C) 用慢病原体（pLV-U6g-EPCG）implantationHeLa细胞核，然后在嘌呤霉素和6TG处置长进行选择以富集HPRT1卢瓦龙县。透过错配测定（CEL-I）在gRNA靶残基检测到填入和缺位。
CRISPR阳性和阴性对照
· 颠末测试和验证的人EMX1DNA阳性对照供给更多了参考根底，并允许研究人员对其DNA组撰稿尝试的效率停止并行评估。
· 可供给更多即用型人一般而言gRNA EMX1阳性对照（CRISPR01-1SET）和CRISPR配对暗语酶（CRISPR02-1SET）。
· 每小我EMX1阳性对照都带有野生型Cas9（CRISPR01-1SET）或暗语酶Cas9-D10A核酸（CRISPR02-1SET）的等分试样。
· CRISPR通用阴性对照（CRISPR06-1EA、CRISPR07-1EA、CRISPR08-1EA）是全机能即用型HIAA级核酸，在CMV启动子下抒发野生型Cas9核酸，以及设想用做抗肿瘤未知的人、小鼠或大鼠DNA的gRNA字符串。
图 7.CRISPR01阳性对照（标为EMX1s4+Cas9的泳道）以及CRISPR02阳性对照（标为EMX1s4, EMX1as4+D10A的泳道）的凝胶 I 图像