岁尾的光阴老是过得十分的快，觉得几个眨眼22年就过往了，觉得啥也没干。今天立冬了，我们北方的童靴已经迎来了降雪，咱们南方的宝宝也要重视添衣保热，不要贪凉哦~
那么本年已经快要完毕了，宝子们是不是该来进修了呀？今天给各人带来的是-血管生成，算一个比力老牌的研究了，但热度不断不错，所以我们今天就来聊一聊血管生成的设想理念。
起首，我们聊聊什么是血管生成？
血管生成是指在原有的毛细血管或微静脉根底上，通过血管内皮细胞的迁徙和增殖，从已存在的血管出以出芽生或非芽生形式构成的新的血管的过程。抗血管生成目前已经成为治疗肿瘤、糖尿病视网膜病、风湿性关节炎等疾病的重要战略之一。
接着，我们来看看血管生成如今的研究行情
目前的SCI颁发情状
血管生成的相关内容，近年来研究报导整体呈上升的形态。
目前国天然课题的立项情状
从国天然近10年立项情状来看（22年的立项未完全录进，不做参考），血管生成在立项数目和帮助金额上逐步趋于不变，每年的立项数目在900个上下浮动。有稳中求胜的宝子们，能够往那个标的目的考虑，可能率不会过时，只要不断研究下往，总有一天能发高分、中面上。
今天给各人介绍文献的标题问题是：Milk exosomes-mediated miR-31-5p delivery accelerates diabetic wound healing through promoting angiogenesis.文章于2022年在 Drug Deliv期刊上颁发（IF=6.819）。
浅析一下血管生成的研究套路，月底将会有1篇高分文章供各人认真品读。
Figure 1 机造图
做者通过差别离心别离了牛奶来源的外泌体（mEXO），并通过电穿孔合成了拆载miR-31-5p的外泌体（mEXO-31）。用mEXO-31处置内皮细胞，发现miR-31-5p在受体细胞中表达上调，而靶基因HIF1AN表达下调。此外，外泌体包被的miR-31- 5p在体外和体内都展现出了强大的促血管生成活性（图1）。
Figure 2 过表达miR-31-5p可促进内皮细胞的增殖、迁徙和血管生成
为了敲定1个miRNA做为研究对象，做者比力了糖尿病和一般小鼠全层皮损中10种miRNA的表达程度，发如今糖尿病伤口中miR-31- 5p的下调具有统计学意义（图2A），故选定miR-31-5p停止后续研究。将miR-31-5p mimic转染到HUVECs中48小时后，通过EdU检测细胞的增殖情状，发现mimic转染细胞HUVECs细胞EdU阳性的更多（图2B，C）。此外，transwell检测展现，miR-31-5p显著增加了HUVECs的迁徙（图2D，E）。最初，我们停止了体外管构成试验，以评估miR-31-5p促进内皮细胞血管生成的才能。与预期一致，管长度增加了近2倍，那表白miR-31-5p显著地促进了血管生成（图2F、G）。综上所述，miR-31-5p在糖尿病小鼠中表达下调，那可能是伤口愈合延迟的原因之一，而miR-31-5p的过表达加强了体外HUVEC的增殖、迁徙和血管生成。
Figure 3 HIF1AN是miR-31-5p的间接靶点
接下来觅觅掌握内皮细胞功用的下流机造，利用了三种独立的算法：starBase、TargetScan和miRDB别离揣测了170个假定的miR-31-5p靶点（图3A）。因为HIF1AN的目标得分在三个基因中更高，故抉择HIF1AN停止进一步研究。miR-31-5p靶向连系 HIF1AN 3’UTR的117-124bp（图3E）。为了进一步证明HIF1AN是miR-31-5p的间接靶点，将miR-31-5p mimic转染到HUVECs中。成果展现，转染HUVECs的miR-31-5p mimic的HUVECs中，HIF1AN程度在mRNA（图3B）和卵白（图3C，D）程度上均下降。然后构建荧光素酶陈述基因（HIF1AN-WT和HIF1AN-MUT）并转染到293 T细胞中。能够看到与空载体比照比拟，miR-31-5p的过表达处置HIF1AN-WT的荧光素酶活性明显被按捺，而HIF1AN-MUT的荧光素酶活性没有显著影响（图3F）。通过western blot检测了糖尿病小鼠伤口组织中HIF1AN的表达程度发现，与一般伤口比拟，糖尿病伤口中HIF1AN表达上调（图3G，H），那与miR-31-5p闪现完全相反的趋向。综上所述，糖尿病伤口中HIF1AN的表达上调，miR-31-5p可通过与HIF1AN mRNA 3’UTR的守旧互补序列连系来按捺HIF1AN的表达。
Figure 4 miR-31-5p/HIF1AN轴调控内皮细胞功用
进一步研究miR-31-5p/ HIF1AN轴在HUVECs中的生物学功用。起首，在差别处置下的HUVECs中检测到HIF1AN卵白程度，发现转染HIF1AN过表达组的HIF1AN程度高于空比照组，按捺了miR-31-5p mimic诱导的HIF1AN含量降低（图4A，B）。HIF1AN的过表达表示出显著的抗增殖感化，并明显按捺了miR-31-5p mimic改进的HUVEC的增殖（图4C，D）。此外，在Transwell迁徙检测中也能够看察到类似的趋向（图4E、F）。我们揣度HIF1AN的过表达能够按捺HUVECs的血管构成，随后的体外管构成尝试证明了那一假设（图4G，H）。HIF1AN过表达消弭了miR-31-5p mimic诱导的血管生成促进感化（图4G，H）。总之，以上尝试证明了miR-31-5p通过靶向HIF1AN促进了内皮细胞的功用。
Figure 5 mEXO-31的造备和表征
为了验证miR-31-5p mimic已胜利加载到mEXO中，摘用RT-PCR办法检测了mEXO、mEXO-NC和mEXO-31中miR-31-5p的程度。成果展现，mEXO-31中的miR-31-5p程度显著高于mEXO或mEXO-NC（图5A）。此外，共聚焦激光扫描显微镜看察到FAM标识表记标帜的miR-31-5p mimic被胜利地加载到mEXO中（图5B）。通过NTA丈量，mEXO和mEXO-31的均匀尺寸曲径别离为131.1和133.6nm（图5D）。通过透射电镜看察到向内凹的铜状构造（图5E）。Westernblot阐发展现，存在外泌体特异性标识表记标帜物CD9、CD81、HSP70、TSG101的高表达（图5(F)）。那些数据表白，通过电穿孔将miRNA加载到mEXO中，对mEXO的颗粒大小、形态或外表标识表记标帜物几乎没有影响。
进一步切磋mEXO对miRNA的庇护水平。将游离的miR-31-5p mimic与mEXO和mEXO-31混合，表露于37℃中5天，然后检测miR-31-5p程度。成果展现，游离的miR-31-5p mimic在第5天几乎完全降解，相反，mEXO中超越60%的miR-31-5p连结不变（图5C），表白mEXO具有庇护miR-31-5p mimic免受降解的才能。
Figure 6 mEXO-31能更有效地将miR-31-5p传递到细胞中
为了检测mEXO-31的转染效率，别离用PBS、游离miR-31-5p mimic、mEXO和mEXO-31转染HUVECs，并用共聚焦激光扫描显微镜检测转染效率。如图6A所示，当mEXO-31处置细胞时，几乎所有的HUVECs都胜利转染了miR-31-5p，而在游离mimic处置时，细胞中几乎没有检测到miR-31-5p。然后，我们别离用PBS、游离mimic-NC、游离miR-31-5p mimic、mEXO、mEXO-NC和mEXO-31处置HUVECs。摘用RT-PCR检测HUVECs中miR-31-5p的表达程度，成果展现mEXO-31组的miR-31-5p程度明显高于其他各组（图6B）。此外，经mEXO- 31处置的HUVECs中HIF1AN卵白程度显著下调，而其他组中HIF1AN卵白程度连结稳定（图6C，D）。那些成果配合表白，游离miRNA很难被细胞吸收，而基于miRNA的治疗办法的窘境能够被牛奶外泌体传递系统突破。此外，在mEXO中封拆的miR-31-5p的生物学功用得以保留，并可降低靶基因HIF1AN的表达。
Figure 7 mEXO-31在体外促进内皮细胞的增殖、迁徙和血管生成
为了进一步研究mEXO-31对HUVECs的功用影响，别离用mEXO、mEXO-NC和mEXO-31处置HUVECs细胞。然后，通过EdU阐发、Transwell阐发和管构成阐发来评估细胞行为。与预期一致，mEXO-31处置极大地促进了细胞增殖：与其他组比拟，mEXO-31组中EdU阳性HUVECs的发作率增加了2倍以上（图7A，B）。当mEXO-31处置HUVECs时，细胞迁徙量增加了约1.5倍（图7C，D）。用mEXO-31刺激HUVECs显著促进了体外管的构成，mEXO-31组的总管长度比其他组增加了近2倍（图7（E，F））。以上证据强烈表白，mEXO和游离miR-31-5p mimic都不克不及促进内皮细胞功用，而mEXO传递miR-31-5p可显著进步miR-31-5p的生物操纵度，从而改进HUVECs的增殖、迁徙和管构成。
Figure 8 mEXO-31加速糖尿病创面愈合
为了切磋mEXO-31在临床治疗中的潜力，在糖尿病小鼠背侧成立全层创面模子，并利用PBS、游离mimic-NC、游离miR-31- 5pmimic、mEXO、mEXO-NC和mEXO-31治疗小鼠。创面成立的第5、10和15天，用mEXO-31处置的小鼠的未闭合伤口率最小（图8A，B）。有趣的是，在游离的miR-31-5p mimic治疗的糖尿病创面中，未闭合的创面率低于比照组、NC、mEXO和mEXO-NC组（图8A，B）。然而，与mEXO-31比拟，游离miR-31-5p mimic的治疗效果远不克不及令人称心。然后，停止组织学阐发，切磋差别治疗组在术后第15天的伤口修复效率。HE染色阐发展现，mEXO-31处置组的再上皮化率较其他处置组更高（图8C、D）。此外，Masson染色阐发展现，mEXO-31组的胶原堆积情状优于其他各组（图8E，F）。mimic组与比照组、NC、mEXO或mEXO-NC组之间的胶原堆积没有差别（图8E，F）。如图8G-J所示，在比照组、NC、mEXO和mEXO-NC组的伤口组织中很少有血管，而游离miR-31-5p mimic改进了血管收集的构成。值得重视的是，mEXO-31组的血管密度更高。那些数据表白，mEXO-31通过促进创面再上皮化、胶原堆积和血管生成，显著加速糖尿病创面愈合。
最初总结一下：
做者开发了一种新的战略，通过将miR-31-5p加载到牛奶来源的外泌体中来加速糖尿病创面愈合。牛奶外泌体做为一种miRNA传递系统具有浩荡的潜力，它能够加强miRNA的不变性和细胞摄取。外泌体包裹的miR-31-5p通过下调HIF1AN的表达，显著改进了内皮细胞的功用，并加强了糖尿病创面的愈合过程。miR-31-5p外泌体的那种感化阐了然其在治疗糖尿病伤口中的感化，做者揣测牛奶外泌体在核酸药物传递中可能存在浩荡的利用潜力。
目前miRNA的研究热度已经逐步下降，假设有小伙伴已经做了组学挑选出不错的miRNA，不想舍弃那部门成果的，能够考虑参考本文做者的研究构想，属于是“山重水复疑无路，柳暗花明又一村”的不测欣喜哟。
好啦~以上就是本次文献分享的全数内容
下期我们再正式拆解一篇高分的血管生成机造研究的计划套路~
假设你感兴致的话，就戳个存眷吧~
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